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Taq Plus DNA聚合酶(P1031-P1032-P1033-P1034)

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P1031(250U) P1032*(250U) P1033(1000U) P1034*(1000U)

Taq Plus DNA聚合酶

Cat. #P1031,P1032,P1033,P1034

產品簡介

Taq Plus DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶與Pfu DNA聚合酶的獨特比例混合物。其保真性是Taq DNA聚合酶的4倍,擴增片段的長度可達20 kb(簡單模板)。在擴增復雜模板(如GC-rich或重復序列)時,Taq Plus DNA聚合酶的擴增效率高于Taq DNA聚合酶,可用于復雜模板的PCR擴增。延伸速度為20s/kb70~75℃,簡單模板可達5s/kb)。擴增產物具有兩種末端:平末端與3'-dA。

產品組成

Component

P1031

250U

P1032

250U

P1033

1,000U

P1034

1,000U

Taq Plus DNA聚合酶(5U/μl[1]

50 μl

50 μl

200 μl

200 μl

Taq Plus DNA聚合酶(2.5U/μl[1]

100 μl

100 μl

400 μl

400 μl

10× Tpol BufferMg2+ Plus[1]

1.25 ml

1.25 ml

1.25 ml × 4

1.25 ml × 4

6× Loading Buffer[2]

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

dNTPs2.5mM[3]

-

1 ml

-

1 ml × 4

[1] 提供5U/μl2.5U/μl兩種活性單位的包裝可供選擇,如無特別說明默認5U/μl。

[2] 10× Tpol Buffer分為Mg2+ PlusMg2+ Free兩種包裝,可方便選擇。如無特別說明提供10× Tpol BufferMg2+ Plus)。Mg2+ Free10× Tpol Buffer提供25 mM MgSO4。提供5U/μl2.5U/μl兩種活性單位的包裝可供選擇,如無特別說明默認5U/μl。

[3] 6× Loading Buffer,如有需要可單獨購買(Cat. #M9041)。

[4] dNTPsdATP、dGTP、dCTPdTTP等摩爾混合物,P1011/P1013不含dNTPs,如有需要請單獨購買(Cat. # P9011/P9012/P9013)。

活性定義

一個活性單位(U)指用活性化的大馬哈魚精子DNA作為模板/引物,在72℃、30 min內,攝入10 nmol全核苷酸所需的酶量。

保存條件

-20℃保存2年。

質量控制

純度檢測:經質量檢測,產品不含脫氧核糖核酸內切酶、脫氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。

功能檢測:PCR方法檢測無宿主殘余DNA,能有效擴增人基因組中的單拷貝基因。

應用舉例

1. 配制反應體系

請于冰上配置反應體系,體系大小與組分用量與添加順序可調整:

Ordinal

Component

Volume

(50 μl reaction volume)

Final   concentration

(50 μl reaction volume)

1

10× Tpol BufferMg2+ Plus

5 μl

2

dNTPs2.5mM

4 μl

0.4 mM

3

upstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

4

downstream primer (10 μM)[1]

2 μl

0.4 μM

5

Taq Plus DNA聚合酶(5U/μl[2]

0.5 μl

2.5U

6

template DNA[3]

1-4 μl

<1μg

7

超純水[4]

To 50 μl

-

optional

MgCl2(MgSO4)/PCR Enhancer[6]

Variable

-

[1] 引物終濃度建議范圍:0.1-1 μM。特異性差時可降低濃度,效率低時可提高濃度。

[2] 根據目的片段擴增的難易程度調整酶的用量。

[3] 不同模板最佳用量不同,部分DNA模板建議用量如下表(50 μl反應體系)。

Template

Dosage

人類基因組DNA

0.1μg-1μg

λDNA

0.5ng-5ng

大腸桿菌基因組DNA

10ng-100ng

質粒DNA

0.1ng-10ng

[4] 可單獨訂購超純水(Cat. #P9021/P9022/P9023)。

[5] 可單獨訂購25mM MgCl2Cat. #P9031)和PCR EnhancerCat. #P9041)。

2. 設定反應程序進行PCR反應

Stage

Temperature

Time

Number of Cycles

Initial Denaturation

94℃

3 min

1

Denaturation

94℃

30 sec

25-35

Annealing

55-68℃[1]

30 sec

Extension

72℃

Variable[2]

Final Extension

72℃

5-10 min

1

[1] 退火溫度應根據Tm值較低的引物來設。

[2] 延伸時間按20s/kb來設最佳(簡單模板可達5s/kb)。

3. 分析結果

將產物與loading buffer混勻后進行瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像設備觀察目的條帶的擴增情況。如有需要,可進行割膠回收。

無產物或產物量少的改進措施有:1調整退火溫度;2減少抑制劑的影響,如提取的基因組DNA中含有抑制擴增的成分,需要高倍稀釋(1: 10000)后使用;3采用乙醇沉降洗脫,提高模板DNA的純度;4使用PCR添加劑,如PCR EnhancerCat. #P9041、MgCl2Cat. #P9031等可提高產量。

操作注意事項

1 室溫下Taq Plus DNA聚合酶有一定的活性,為避免發生非特異性擴增,請于冰上配置反應體系,并且最后添加Taq Plus DNA聚合酶或模板DNA。

2 Taq Plus DNA聚合酶的擴增產物有兩種末端:平末端和3'-dA突出末端。如要進行TA克隆,請先進行加A反應,以提高克隆效率。(加A反應:參考如下體系,72℃,15-30min

PCR(純化)產物

1-7 μl

10× Taq BufferMg2+ Plus

1 μl

dATP

0.2 mM

Taq DNA聚合酶

5U

超純水

To 10 μl

引物設計注意事項

引物長度一般在15-30個堿基之間;上下游引物3’末端避免互補,避免出現3個以上重復的GC,或出現發夾結構,否則會產生非特異性擴增;GC含量控制在40-60%,且上下游引物GC含量盡量接近;Tm值控制在55-65℃之間,且上下游引物Tm值盡量接近,額外附加序列(酶切位點、修飾等)是非模板匹配序列,不參與Tm值計算。

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名稱

貨號

規格

PCR Mix

P2011/P2012/P2013/P2014/P2015

1ml/5ml/10ml/50ml/100ml

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更多PCR酶、DNA Marker及核酸提純類產品請登錄東盛生物官網查詢。

 


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